Молекулярная масса белков и способы ее определения

Методы нахождения молекулярной массы белка бывают химическими, физико-химическими и физическими. Самыми распространенными физико-химическими методами являются гель-хроматография (как колоночная, так и тонкослойная) и электрофорез в среде полиакриламидного геля в присутствии натрия додецилсульфата. Они не требуют сложного оборудования и больших количеств исследуемого материала.

структуры белковых молекул

Характеристика белков

Белки представляют собой высокомолекулярные полимеры биологического происхождения. Они состоят из аминокислот, соединенных последовательно пептидными связями. Размеры белков зависят от количества этих самых аминокислот. Средние значения элементного состава белков в %:

  • углерода – в интервале 50,6-54,5;
  • кислорода – в пределах 21,5-23,5;
  • азота – около 15,0-17,6;
  • водорода –в интервале 6,5-7,3;
  • серы – в пределах 0,3-2,5;
  • минеральных веществ – не более 0,5.

Белки подразделяют на простые, состоящие только из остатков аминокислот, и сложные, включающие простетические группы. Небелковые компоненты могут быть углеводами, липидами, нуклеиновыми кислотами, производными витаминов, ионами металлов, гемом и др. Различают четыре структуры белков.


Виды белков в организме. Строение, функции и свойства полипептидных молекул. Денатурация и...

Аминокислотный состав белков находят путем кислотного гидролиза, сочетаемого с последующим разделением освободившихся аминокислот с помощью ионообменной хроматографии.

общая формула аминокислот

Количественные показатели каждой из аминокислот определяют нин-гидриновым методом. Выявление размещения аминокислот в молекуле белка осуществляют путем последовательного отщепления концевых аминокислот с помощью ферментов и их идентификацией, что позволяет определить структуру белковой молекулы. Идентификация основана на их различных физико-химических свойствах. Нередко для этого используют цветные реакции на те или иные аминокислоты и хроматографию.

Колоночная гель-хроматография

Этот метод основывается на линейной зависимости логарифма молекулярной массы многих глобулярных белков и объема элюирования с заполненной гелем (определенного размера пор). Таким образом, для определения молекулярной массы белка следует лишь найти объем его элюции с откалиброванной заранее колонки. Калибровку выполняют методом пропускания через колонку белков с заранее известными массами молекул и замеряя объемы элюции каждого из них. Если в качестве заполнителя используют сефадекс G-75, то расчет молекулярной массы ведут по найденному экспериментальным путем уравнению:


Наша статья будет посвящена изучению свойств веществ, являющихся основой феномена жизни на Земле....

lg M = 5,624 – 0,752 · (Vэ / Vo),

где М – искомая молекулярная масса; Vэ – выходящий из колонки объем раствора с исследуемым веществом; Vo – объем свободной колонки.

Для проведения анализа понадобятся раствор голубого декстрана (1%), раствор NaCl (0,1 моль/л), сефадекс G-75 (4 г), раствор гемоглобина (1%).

хроматографическая колонка

Выполнение анализа

Подготовленную колонку заполняют гелем сефадекса G-75 и промывают раствором NaCl. После того как сольют раствор NaCl, поднимающийся выше уровня геля, на его поверхность аккуратно помещают 0,5 мл раствора голубого декстрана. Затем собирают выходящие из колонки жидкости в мерный цилиндр, где их сохраняют до конца эксперимента. Начинающий вытекать раствор с голубой окраской собирают по 20 капель в подготовленные заранее пробирки. Элюат из них от первого до самого интенсивно окрашенного сливают в тот же мерный цилиндр, в котором уже собраны неокрашенные фракции. Объем пробирок ослабевающей окраской раствора не учитывают.


Макромолекула - это высокомолекулярное соединение, имеющее значение для жизнедеятельности...

Объем жидкости, собранной в мерный цилиндр, составляется свободным объемом колонки (Vo). Далее повторяют заполнение колонки, но вместо голубого декстрина используют раствор гемоглобина. Объем элюата в мерном цилиндре до выхода раствора с максимально розовой окраской является величиной Vэ. Найденные значения Vo и Vэ подставляют в соответствующее уравнение и вычисляют массу белка. Аминокислотный состав белков находят подобными методиками.

определение молекулярной массы белка, сефадекс

Тонкослойная гель-хроматография

Принцип этого метода заключается в том, что в ходе продвижения раствора белков по пластине с тончайшим слоем сефадекса, смесь их распределяется неравномерно. По расстоянию, пройденному каждым из белков от исходной стартовой линии, находят логарифмы их молекулярных масс. Для определения молекулярной массы белка методом тонкослойной гель-хроматографии строят калибровочный график, отражающий зависимость пройденных маркерными белками расстояний от логарифмов их молекулярных масс. Уже по нему находят длину пути исследуемого белка и массу его молекулы.

Для выполнения эксперимента потребуется столик с изменяющимся углом наклона, а также хроматографическая камера. Из реактивов понадобятся сефадекс G-200 или G-150, натрий-фосфатный буфер, pH 7,4 (0,1 моль/л), раствор бромфенолового синего (0,1%), раствор СН3СООН (5%), раствор CH3COONa (2 %), набор маркерных белков, хроматографическая бумага.

Выполнение эксперимента

Сначала необходимо приготовить гель сефадекса, для чего сухую его массу 4 г суспендируют в избыточном количестве натрий-фосфатного буфера, а затем оставляют для набухания в течение 3 суток при н.у. Стеклянную пластинку со сторонами 20х40 см тщательно промывают. Перед нанесением на нее сефадекса буфер над ним декантуют, а затем гель хорошо перемешивают. На горизонтально расположенную пластину его наносят фарфоровой ложечкой, а затем распределяют прокатыванием стеклянной палочки размером 1х22 см. Прокатывание повторяют до равномерного распределения слоя геля без комков и пузырьков толщиной 1 мм. Подготовленную пластинку просушивают на воздухе 15 мин., а потом помещают в хроматографическую камеру.

обработка результатов тонкослойной хроматографии

В крайние емкости заливают фосфатный буфер, гель соединяют с буфером хроматографической бумагой. Далее камеру закрывают и помещают на специальную подставку. Угол ее наклона устанавливают на 7-10°. Для насыщения камеру оставляют на ночь.

Растворы белков, молекулярная масса которых известна, так же, как и исследуемые образцы, наносят микропипеткой, объем каждой порции должен быть по 0,02 мл. Пластинку возвращают в горизонтальное положение и наносят порции белка в определенные точки. Расстояние между ними и от верхнего края должно быть 3 см. Затем камеру закрывают и ставят под углом 7–10°. Гель-хроматографический анализ проводят 4 ч.

По истечении отведенного времени камеру ставят горизонтально, хроматографическую бумагу удаляют. Стеклянную пластинку помещают на подставку в горизонтальном положении и снимают "реплику" на бумагу для хроматографии. Для этого ее сворачивают в трубочку и накладывают на тонкий гелевый слой, постепенно разворачивая. При этом бумага должна прилипнуть к нему, но делать это нужно аккуратно, чтобы сохранить его в целости. Бумагу оставляют на поверхности пластинки 1 мин., после этого высушивают при температуре 90 °С 20 мин. и помещают в специальную кювету для окрашивания.

Расшифровка результатов

Чтобы идентифицировать белковые зоны, "реплику" помещают в раствор бромфенолового синего на 3 минуты. Далее краситель нужно отмыть дважды раствором уксусной кислоты и закрепить ацетатом натрия. После этого хроматографическую бумагу тщательно промывают в холодной проточной воде и высушивают. Далее приступают к измерению расстояния, пройденного каждым белком от исходной точки до центра пятна.

По полученным данным выстраивают калибровочный график, путем откладывания по оси абсцисс lа/lст (где индекс а относится к анализируемому, а ст - к стандартному белку), по оси ординат – lgM. Замерив расстояние белковой области исследуемого образца от старта, по выстроенному графику определяют молекулярную массу и предполагаемую структуру белковой молекулы.

Продукты распада белков в организме: специфические особенности, ...
Жизнь без белка невозможна. Значение белков для организма заключается в том, что они служат материалом для построения клеток, тканей и органов, образования ферментов, большинства гормонов, гемоглобина и других веществ, выполняющих в организме ...
далее
Глобулярный белок: структура, строение, свойства. Примеры глобулярных ...
Большое количество органических веществ, входящих в состав живой клетки, отличаются крупными размерами молекул и представляют собой биополимеры. К ним относятся и белки, составляющие от 50 до 80% от сухой массы всей клетки. Мономерами белков ...
далее
Физические свойства белков. Важнейшие химические свойства белков
Когда заходит речь о правильном питании, то сразу же говорится об углеводах, жирах и белках. Но что же такое белок с точки зрения химии? Какими же свойствами он обладает? И почему белок так нужен организму?
далее
Белок: строение и функции. Свойства белков
Белок: строение, выполняемые функции. Пространственные структуры пептидов. Физические и химические свойства белков, примеры. Классификация молекул полипептидов.
далее
Какое значение белков в организме человека
Для полноценного функционирования организму необходимы питательные вещества: белки, жиры, углеводы, витамины. Остановимся на их особенностях, биологическом значении, функциях, выполняемых в живом организме.
далее
Гистоновые и негистоновые белки: виды, функции
Что представляют собой негистоновые белки? Каковы их основные функции? Чем они отличаются от гистоновых белков? Вместе будем искать ответы на поставленные вопросы.
далее
Гистоновые и негистоновые белки: виды, функции
Какими бывают виды белков, их функции и структура
Виды белков в организме. Строение, функции и свойства полипептидных молекул. Денатурация и ренатурация пептидов, гидролиз. Структура белковых молекул.
далее
Какими бывают виды белков, их функции и структура
Факторы, определяющие растворимость белков. Физико-химические свойства белков
Наша статья будет посвящена изучению свойств веществ, являющихся основой феномена жизни на Земле. Белковые молекулы присутствуют в неклеточных формах – вирусах, входят в состав цитоплазмы и органоидов прокариотических и ядерных клеток. Наряду с нуклеиновыми кислотами они образуют вещество наследственности – хроматин и формируют главные компоненты ядра - хромосомы.
далее
Факторы, определяющие растворимость белков. Физико-химические свойства белков
Макромолекула - это молекула с высокой молекулярной массой. Конфигурация макромолекулы
Макромолекула - это высокомолекулярное соединение, имеющее значение для жизнедеятельности организмов. Проанализируем особенности структур макромолекул, их конфигурации, области применения.
далее
Макромолекула - это молекула с высокой молекулярной массой. Конфигурация макромолекулы
Глобулярные и фибриллярные белки: типы белков, свойства
Фибриллярные белки - те, что имеют структуру в виде нити. Они не растворяются в воде и имеют массу молекулы очень большую, структура которой высокорегуляторная, она приходит в устойчивое состояние благодаря взаимодействиям между разными цепями полипептидов. Эти цепи находятся синхронно друг к другу на одной плоскости и создают так называемые фибриллы.
далее
Глобулярные и фибриллярные белки: типы белков, свойства